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25-OH 維他命D（總）檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）
（德國DRG*，貨號：EIA5396）
德國DRG中國*代理商“深圳科潤達生物工程有限公司”竭誠為您服務(wù)

 
預(yù)期用途
此試劑盒用于血清和血漿中總25羥基維他命D（維他命D2和維他命D3）的檢測
 
實驗原理
此試劑盒基于競爭酶聯(lián)免疫法
首先，由于體內(nèi)多數(shù)循環(huán)25-OH VD 束縛于VDBP，因此結(jié)合樣本需先經(jīng)過變性緩沖液的預(yù)處理來提取分析物；中和反應(yīng)后，生物素化的25-OH VD（酶聯(lián)物）與過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素加入，混勻，加入微孔板內(nèi)，樣本中的內(nèi)源性25-OH VD與25-OH VD-生物素酶聯(lián)物競爭結(jié)合包被板上包被的VDBP，結(jié)合的生物素化的25-OH VD由過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素檢測，孵育，洗板，除去未結(jié)合的成分，加入底物液發(fā)生顏色反應(yīng)，一定的時間后加入終止液；顏色強度與樣本中的25-OH VD濃度成反比
 
注意事項
 

1. 此試劑盒僅供研究及專業(yè)人士使用
2. 試劑盒內(nèi)所有含有人血清或血漿的試劑都經(jīng)FDA批準(zhǔn)進行了檢測，HIV I/II, HBsAg 和HCV都呈陰性；但在使用及處理時還應(yīng)視潛在生物危險物質(zhì)
3. 實驗前，詳細(xì)閱讀完說明書。使用試劑盒內(nèi)提供的有效版本說明書，確保理解所有操作步驟

4. 包被板條為可分拆板條。未使用的微孔板放入密封的小袋中，置于2℃- 8℃下存儲
5. 按相同的順序迅速加樣品和試劑
6. 每種不同試劑都用單獨的容器盛放，特別是底物液。將底物液盛放在曾經(jīng)保存過酶聯(lián)物的容器中，會導(dǎo)致變色。切勿將試劑倒回小瓶中，避免污染
7. 為得到*結(jié)果，充分混勻微孔中的溶液。別重復(fù)使用包被板
8. 實驗過程別讓微孔靜置干燥。各步驟加試劑后，應(yīng)充分洗板
9. 實驗前，將所有試劑平衡至室溫（21℃－26℃）。溫度會影響實驗讀數(shù)，然而，樣品的測量濃度值不受影響
10. 切勿用嘴移液,避免皮膚和黏膜接觸試劑和樣品
11. 別在樣品和試劑處理實驗區(qū)吸煙，飲食和化妝
12. 處理樣品和試劑時,請戴一次性手套.微生物感染的試劑盒樣本會導(dǎo)致錯誤的實驗結(jié)果.
13. 根據(jù)相關(guān)國家生物有害物質(zhì)安全條例或規(guī)范操作
14. 別使用過期的試劑, 有效期見標(biāo)簽
15. 嚴(yán)格依據(jù)說明書要求，所有試劑的加樣量準(zhǔn)確。只有使用標(biāo)準(zhǔn)移液管和標(biāo)準(zhǔn)酶標(biāo)儀才能得到*結(jié)果
16. 不要將不同批次的試劑混合使用，也不建議將同一批次的板條進行互換，試劑盒裝運或儲存的環(huán)境不一樣也會導(dǎo)致結(jié)果有微小的不同
17. 避免接觸酸性終止液（0.5 M硫酸），以免灼傷和刺激皮膚
18. 有些試劑盒含Proclin 300, BND或MIT作為防腐劑。如不慎接觸眼睛或皮膚，用大量清水沖洗
19. TMB底物液對皮膚和粘膜有刺激作用。如不慎接觸眼睛，用大量的清水沖洗，如不慎接觸皮膚，用香皂和清水清洗。如不慎吸入，帶傷者至空氣流通的地方
20. 化學(xué)物質(zhì)和試劑盒必須根據(jù)相關(guān)國家生物有害物質(zhì)安全條例或規(guī)范進行處理
21. 有關(guān)生物危害的詳細(xì)信息見物料安全數(shù)據(jù)單, 物料安全數(shù)據(jù)單可直接向DRG公司獲取
試劑盒組成
 

1. 包被板，96孔，可拆，包被了維他命D結(jié)合蛋白（VDBP）
2. 標(biāo)準(zhǔn)品（0-5），6瓶，1ml，即用，濃度：0-4-10-25-60-130pg/ml；轉(zhuǎn)換：1 ng/mL = 2.5 nmol/L.標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)NIST SRM校準(zhǔn)；含無汞防腐劑
3. 高低質(zhì)控，2瓶，1ml，即用，質(zhì)控品具體數(shù)值及范圍見QC指控單，含無汞防腐劑
4. 變性緩沖液，1瓶，10ml，即用
5. 中和緩沖液，1瓶，25ml，即用，含無汞防腐劑
6. 酶聯(lián)物，1瓶，7ml，即用，生物素化維他命D3，含無汞防腐劑
7. 酶聯(lián)混合物，1瓶，7ml，即用，鏈霉親和素-過氧化物酶，含無汞防腐劑
8. 底物液，1瓶，25ml，即用，TMB
9. 終止液，1瓶，14ml，即用，含0.5M的硫酸
10. 洗滌液，1瓶，30ml，40倍濃縮
11. 蓋板，1塊

注意：根據(jù)需要可額外訂購樣本稀釋用的零標(biāo)準(zhǔn)品
 
實驗所需材料但試劑盒未提供
 

1. 用于維他命D釋放的玻璃瓶
2. 孵箱37℃
3. 酶標(biāo)儀（450±10nm）
4. 校準(zhǔn)的移液器
5. 吸水紙
6. 去離子水或雙蒸水
7. 計時器
8. 半對數(shù)坐標(biāo)紙或數(shù)據(jù)處理軟件

 
貯存條件
未開封的試劑在2-8℃下可保存至有效期，不要使用過期的試劑
開封的試劑和包被板必須貯存于2-8℃，密封袋一旦打開后，應(yīng)立即密封好
開封的試劑盒若按上述方法保存可保持2個月的活性
 
試劑準(zhǔn)備
實驗前將所有試劑和試驗所需板條平衡至室溫
洗滌液
30ml的濃縮洗滌液+1170ml的去離子水混勻，得到1200ml的即用型洗滌液，稀釋的洗滌液可在室溫下保存2周
 
試劑盒處理
根據(jù)相關(guān)國家規(guī)范處理廢棄試劑盒. 試劑盒的特別信息見物料安全數(shù)據(jù)單
 
損壞的試劑盒
萬一試劑盒或試劑成分受到損壞,收到試劑盒zui遲1周以書面形式通知DRG. ，嚴(yán)重受損的試劑組分不能用于實驗.
保存受損試劑組分,直至找到好的解決方法. 根據(jù)*規(guī)范處理損壞組分.
 
樣本
此次試驗采用血清或血漿（EDTA;肝素；檸檬酸鹽血漿）樣本
不要使用溶血，脂血，黃疸血樣本
注意:不要使用含有疊氮化物的樣本
 
樣本采集
血清
靜脈采血采集全血，立即凝集，室溫下離心分離出血清；樣本未*凝集前不能離心；接受抗凝劑治療的病人可能需要更長的凝集時間
血漿
將全血采集至含有抗凝劑的采血管內(nèi)，離心便可
 
樣本貯存和準(zhǔn)備
樣本采集后蓋好蓋子，2-8℃下可保存3天；若要保存更長時間，則需凍存于-20℃；避免反復(fù)凍融
 
樣本稀釋
初次試驗中，若出現(xiàn)樣本的濃度值高于zui高標(biāo)準(zhǔn)，則需將樣本進行進一步的稀釋，并重新檢測，zui終結(jié)果應(yīng)乘以相關(guān)的稀釋因子
例如：
A）1:10稀釋           10ul的血清+90ul的零標(biāo)準(zhǔn)品（充分混合）
B）1:100稀釋               10ul  A）1:10稀釋的+90ul的零標(biāo)準(zhǔn)品（充分混合）
 
實驗步驟
一般注意事項
–使用前，將所有的樣品和試劑平衡至室溫。試劑混勻，避免產(chǎn)生氣泡
–實驗開始后，所有步驟應(yīng)無中斷連續(xù)進行下去
–使用新的一次性加樣槍頭，加標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控品，樣品，避免交叉污染
–吸光度值是受孵育時間和溫度影響。實驗前，請準(zhǔn)備好所有的試劑，打開瓶蓋，保證所需包被板條置于板架上確保所有的加樣時間間隔相等，無間斷
–一般情況，酶反應(yīng)與時間和溫度成線性相關(guān)
 
試驗操作
每次實驗都應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線
所有標(biāo)準(zhǔn)品，樣本和質(zhì)控都做雙孔檢測；所有的標(biāo)準(zhǔn)品，樣本和質(zhì)控都在同一時間內(nèi)操作，確保實驗環(huán)境一致
 
樣本預(yù)處理步驟
 

1. 將試驗所需的玻璃瓶或未包被的包被板固定好
2. 每玻璃瓶加25ul的標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控和樣本，每次加樣更換新槍頭
3. 每玻璃瓶加50ul的變性緩沖液
4. 蓋上蓋子，37℃下孵育30min
5. 每玻璃瓶加200ul的中和緩沖液
6. 每玻璃瓶加50ul的酶聯(lián)物
7. 每玻璃瓶加50ul的酶聯(lián)物混合物
8. 充分混合10秒，充分混合這一步相當(dāng)重要；然后吸取200ul 此混合溶液用于ELISA試驗

 
ELISA 步驟
 

1. 將實驗所需板條固定于板架上
2. 加200ul上述已預(yù)處理的標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控品和樣本于相應(yīng)的微孔內(nèi)
3. 蓋板，37℃下孵育60min
4. 棄去孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔加300ul的洗滌液洗板4次，吸水紙上拍干

  注意：試驗的靈敏度和度與洗板是否*緊密相關(guān)
 

1. 每孔加200ul的底物液
2. 室溫下孵育15min
3. 每孔加100ul的終止液
4. 加完終止液后10min內(nèi)在酶標(biāo)儀450±10nm處讀數(shù)

 
結(jié)果計算
 

1. 計算各標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控品和樣本的吸收值均值
2. 在半對數(shù)坐標(biāo)紙或線性坐標(biāo)紙上以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為X軸，吸收值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
3. 以樣本的吸收值可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到相應(yīng)的濃度值
4. 自動計算方法：說明書中的標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過4參數(shù)邏輯函數(shù)法計算得到，4PL是*方法，其他的方法可能會有些許的偏差
5. 樣本濃度可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀?。蝗魳颖緷舛戎蹈哂趜ui高標(biāo)準(zhǔn)品，則需進一步稀釋重新檢測或結(jié)果記錄為＞130ng/mL；zui終結(jié)果計算時應(yīng)乘以相關(guān)的稀釋因子

 
本譯文僅供參考，請以原說明書為準(zhǔn)
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