內(nèi)皮素-1 ELISA試劑盒-深圳市科潤達生物工程有限公司

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內(nèi)皮素-1 ELISA試劑盒

內(nèi)皮素-1 ELISA試劑盒

日本IBL*，貨號：27165

日本IBL中國*代理商“深圳科潤達生物工程有限公司”竭誠為您服務(wù)

1、前言說明

內(nèi)皮素-1（一種21個氨基酸分子組成的多肽）是目前所知的zui有效的血管收縮劑。1985年Rubanyi研究小組發(fā)現(xiàn)了一種多肽并將其命名為內(nèi)皮源性收縮因子（EDCF），之后Yanagisawa將其分離、測序、克隆，并命名為內(nèi)皮素，而且認為它是zui有效的血管收縮劑，這使得人們了解到它更多的生理功能。內(nèi)皮素-1（ET-1）是哺乳動物三種血管活性肽家族中的一種，這三種血管活性肽還包括內(nèi)皮素-2和內(nèi)皮素-3。這兩種相關(guān)多肽的2和6號位的氨基酸與ET-1的不同。這些基因可以產(chǎn)生三種前肽，之后可分解成三個含39個氨基酸分子的內(nèi)皮素分子。我們可以獲得一系列內(nèi)皮素多肽和前肽家族的功能概述和分子生物學(xué)知識。ET-1對平滑肌細胞、成纖維細胞有強烈效應(yīng)，并且它也參與很多疾病過程，特別是心血管疾病。ET-1在充血性心力衰竭、腎衰竭和肺動脈高血壓中有重要作用。人的ET-1和牛、犬、鼠、豬、兔和大鼠的ET-1有相同的氨基酸序列。

2、日本IBL*，內(nèi)皮素-1 ELISA試劑盒實驗原理

此試劑盒是一種夾心法的ELISA試劑盒，整個試劑盒使用了兩種高特異性的抗體。TMB作為顯色劑，zui終溶液所顯示的顏色強度與樣品中ET-1的量成正比。測量范圍：0.78～100pg/ml

3、日本IBL*，內(nèi)皮素-1 ELISA試劑盒應(yīng)用范圍

IBL的ET-1 ELISA試劑盒可用于人血清、EDTA血漿、細胞培養(yǎng)液上清和組織提取液中ET-1的定量檢測。

4、日本IBL*，試劑盒成分

1）包被板：微孔用抗ET^15-21兔IgG包被，96孔。

2）濃縮型酶標(biāo)抗體：HRP標(biāo)記的抗ET-1兔IgG Fab片段，30倍濃縮，0.4ml。

3）標(biāo)準(zhǔn)品：ET-1，0.5ml×2。

4） EIA緩沖液：內(nèi)含1%的BSA、0.05%的吐溫20的PBS緩沖液，30ml。

5）用于稀釋酶標(biāo)抗體的稀釋液：內(nèi)含的1%BSA、0.05%的吐溫20的PBS緩沖液，12ml。

6）顯色劑：TMB底物液，15ml。

7）終止液：1N的H2SO4，12ml。

8）濃縮洗滌液：內(nèi)含0.05%吐溫的磷酸緩沖液（40倍濃縮），50ml。

5、日本IBL*，操作指南

A、實驗所需器材但試劑盒不提供

1）酶標(biāo)儀（450nm）

2）微量移液器和取樣吸頭

3）帶刻度的量筒與燒杯

4）蒸餾水

5）溫育器（37℃±1℃）

6）冷床箱（4℃）

7）坐標(biāo)紙（log/log）

8）吸水紙

9）用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的試管

10）洗滌瓶

11）酶標(biāo)抗體稀釋的一次性試管

12）提取用的Sep-Pak C-18柱和試劑，見“樣品處理應(yīng)注意的問題”

B、試劑準(zhǔn)備

1）洗滌液的準(zhǔn)備：洗滌液是一種40倍濃縮的緩沖液，使用前應(yīng)當(dāng)將洗滌液平衡至室溫，并混合均勻。用1950ml蒸餾水稀釋50ml濃縮洗滌液，混合均勻，這就是即用型的洗滌液。稀釋后的洗滌液應(yīng)當(dāng)儲存于冰箱中至2周

2）酶標(biāo)抗體的準(zhǔn)備：標(biāo)記抗體是30倍濃縮的，根據(jù)實驗所需要的量，用酶標(biāo)抗體稀釋液將濃縮酶標(biāo)抗體稀釋30倍，稀釋后就可以用了。例如：如果您檢測8孔，則需要800ul即用型的酶標(biāo)抗體（用870ul酶標(biāo)抗體稀釋液稀釋30ul濃縮的酶標(biāo)抗體，并混合均勻，使用時每孔加100ul）。酶標(biāo)抗體應(yīng)當(dāng)在使用前臨時將其準(zhǔn)備好。剩余的濃縮酶標(biāo)抗體應(yīng)當(dāng)密封儲存于4℃的環(huán)境下。

3）標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備：在試管內(nèi)，用0.5ml蒸餾水稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，并混合均勻，稀釋后ET-1標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為200pg/ml。

4）標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋準(zhǔn)備9個試管，在每個試管中加入230ul EIA緩沖液。每支試管的具體濃度如下：

試管1	100pg/ml
試管2	50pg/ml
試管3	25pg/ml
試管4	12.5pg/ml
試管5	6.25pg/ml
試管6	3.31pg/ml
試管7	1.56pg/ml
試管8	0.78pg/ml
試管9	0pg/ml（檢測樣品對照孔）

將230ul標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入到試管1中，混合均勻；之后將230ul試管1中的溶液加入到試管2中，將標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)兩倍稀釋來確定8點標(biāo)準(zhǔn)品（濃度為100pg/ml到0.78pg/ml），EIA緩沖是檢測樣品空白對照，濃度為0pg/ml。

如圖：

5）檢測樣品的稀釋：如果有必要稀釋的話，用EIA緩沖液稀釋檢測樣品。如果您要用血清、血漿或組織樣做樣品，有必要用Sep-Pak C-18提取柱進行預(yù)提取。（見 “樣品處理應(yīng)注意的問題”）

7、日本IBL*，實驗步驟

在實驗開始大約30分鐘時，將所有的試劑都平衡至室溫。輕輕的并充分混勻試劑。確保所有試劑都未變質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)備應(yīng)當(dāng)與樣品的檢測同時進行。

試劑	檢測樣品	標(biāo)準(zhǔn)品	檢測樣品對照孔	試劑對照孔
試劑	檢測樣品100ul	稀釋標(biāo)準(zhǔn)品（1-8管）100ul	EIA緩沖液（第9管） 100ul	EIA緩沖液100ul
蓋板，4℃下溫育一整夜
洗板7次
酶標(biāo)抗體	100ul	100ul	100ul	-
蓋板，37℃下溫育30min
洗板9次
顯色劑	100ul	100ul	100ul	100ul
室溫避光溫育30min
終止液	100ul	100ul	100ul	100ul
加終止液后30min內(nèi)450nm處讀取OD值

1）確定好空白孔，并在相應(yīng)的微孔中加入100ul EIA緩沖液。

2）確定好樣品對照孔，檢測樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔，然后分別將100ul樣品對照品、檢測樣品和稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品加入到相應(yīng)的微孔中。

3）蓋板，4℃下溫育一整夜

4）用洗滌瓶洗板，在微孔中加入洗滌液再浸泡15-30秒，棄取洗滌液。重復(fù)7次，zui后在吸水紙上拍干。如果是用洗板機洗板時，用洗板機洗四次后，再用洗滌瓶洗3次。

5）每一微孔中加入100ul酶標(biāo)抗體。

6）蓋板，37℃下溫育30min

7）按照步驟4）洗板9次

8）將所需量的顯色劑加入到試管中，然后每孔內(nèi)加入100ul顯色劑。為了避免污染，請勿將剩余試劑在倒入顯色劑原裝瓶中。

9）室溫避光溫育30min，加入顯色劑后溶液顏色會變成藍色

10）在每一微孔中加入100ul終止液，此時溶液顏色會變成黃色。

11）移去包被孔底的雜質(zhì)或水滴，同時確保液體表面無泡沫， 30min內(nèi)在450處讀取OD值。

8、特別注意

1. 樣品采集后應(yīng)立即檢測，如需貯存的，則應(yīng)放置在冰凍條件下，避免反復(fù)凍融，檢測前應(yīng)在低溫下將其溶解并*混合

2. 如有需要，樣品可用EIA緩沖液稀釋

3. 建議試驗樣品和標(biāo)準(zhǔn)品做雙份檢測

4. 試驗樣品應(yīng)在中性PH范圍內(nèi)，有機溶劑的污染會影響試驗

5. 只能使用試劑盒內(nèi)提供的洗滌液洗板，洗板不充足可能會導(dǎo)致試驗失敗

6. *倒去洗滌液，吸水紙上拍干，不能用吸水紙擦拭微孔

7. 底物液應(yīng)避光保存，因其對光敏感，且要避免接觸金屬

8. 加入終止液后30min內(nèi)讀數(shù)

9、結(jié)果計算

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線前，將所有的檢測孔（包括標(biāo)準(zhǔn)品和未知樣品）的OD值都減去檢測樣品空白孔的OD值。在對數(shù)坐標(biāo)紙上，以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值（減去空白后的值）對其相應(yīng)的濃度，通過這些點作一條平滑的標(biāo)準(zhǔn)曲線。我們可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取未知樣品的濃度值。

典型標(biāo)準(zhǔn)曲線

附：采用全自動酶標(biāo)儀檢測，只需檢測前設(shè)置好酶標(biāo)儀的相關(guān)參數(shù)，如坐標(biāo)參數(shù)（線性，半對數(shù)）和計算方式參數(shù)（三次回歸、四參數(shù)或雙對數(shù)曲線方程），即可直接得到結(jié)果

10、樣品處理應(yīng)注意的問題

直接用于檢測的樣品所含蛋白濃度低（如細胞培養(yǎng)液上清，尿液等），但是，抽提物中要求高濃度蛋白（如血漿，血清，組織勻漿等），樣品抽提建議采用Sep-Pak C-18柱：

1. Sep-Pak C-18柱預(yù)處理^（1）

a. 4ml純乙醇沖洗

b. 2ml的去離子水沖洗2次

c. 2ml 0.1%的TFA液沖洗2次

2.樣品預(yù)處理

a. 血漿（血清）-6ml 10%乙酸與2ml血漿混合

b. 組織樣品

（1）組織樣品和勻漿內(nèi)加入1M的乙酸和20mM鹽酸溶液