人粒細胞集落刺激因子（G-CSF） ELISA試劑盒
日本IBL*，貨號：27131
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簡介
G-CSF屬于細胞因子類，刺激中性粒前體細胞的分化和增殖，它由成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，且有報道稱，在某些腫瘤內(nèi)可刺激其增殖。人G-CSF試劑盒可檢測人G-CSF
原理
此試劑盒根據(jù)酶免法的夾心原理，利用兩種不同的高特異性抗體，TMB作為著色劑，顏色強度與人G-CSF的量成正比
檢測范圍
7.81~500pg/ml（37℃下*次孵育1小時）
1.95~250pg/ml（4℃下*次孵育過夜）：內(nèi)部數(shù)據(jù)
預(yù)期用途
1. 此試劑盒用于細胞上清液中人G-CSF的定量檢測
2. 重組的和天然的G-CSF都可以用此試劑盒檢測
3. 經(jīng)驗表明，由于全血的干擾，血清或EDTA血漿的稀釋比例較低可導(dǎo)致結(jié)果更低（見附錄一）
試劑盒組成
1. 包被板，96孔，包被有抗人G-CSF鼠IgG單抗，親和純化
2. 標(biāo)記抗體濃縮，30X，0.4mlx1，HRP標(biāo)記的抗人G-CSF兔IgG Fab’，親和純化
3. 標(biāo)準(zhǔn)品，1.0mlx2，重組人G-CSF
4. EIA緩沖液，30mlx1,1%BSA，含0.05%吐溫20的PBS
5. 標(biāo)記抗體稀釋液，12mlx1,1%BSA，含0.05%吐溫20的PBS
6. 著色劑，15mlx1，TMB底物液
7. 終止液，12mlx1，1N硫酸
8. 洗滌緩沖濃縮液，50mlx1, 40X，含0.05%吐溫20的磷酸緩沖液
實驗所需材料但試劑盒未提供
1. 酶標(biāo)儀（450nm）
2. 移液器和槍頭
3. 燒杯
4. 蒸餾水
5. 孵箱（37±1℃）
6. 坐標(biāo)紙（對數(shù)-對數(shù)）
7. 吸水紙
8. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋管
9. 洗瓶
10. 一次性試驗管
準(zhǔn)備
1. 洗滌緩沖液制備：先將洗滌濃縮液平衡至室溫，充分混勻，然后吸取50ml濃縮液與1950ml的去離子水混勻，即得。配制的洗滌液應(yīng)保存于冰箱內(nèi)，并于2周內(nèi)用完
2. 標(biāo)記抗體的制備：用標(biāo)記抗體稀釋液將標(biāo)記抗體稀釋30倍，即得。
例：如果只測一條板，8孔，則需要標(biāo)記抗體800ul（30ul的標(biāo)記抗體+870ul的標(biāo)記抗體稀釋液，混勻，使用時每孔加100ul）
此步驟在實驗前完成
剩余的標(biāo)記抗體濃縮應(yīng)裝于密封瓶內(nèi)，保存在4℃
3. 標(biāo)準(zhǔn)品的制備：吸取1.0ml的去離子水至標(biāo)準(zhǔn)品瓶內(nèi)，充分混勻，得到1000pg/ml的人G-CSF標(biāo)準(zhǔn)品
4. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：準(zhǔn)備8個試管用于標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋，每管加入230ul的EIA緩沖液
每管的濃度如下
1號管 500pg/ml
2號管 250pg/ml
3號管 125pg/ml
4號管 62.5pg/ml
5號管 31.25pg/ml
6號管 15.63pg/ml
7號管 7.81pg/ml
8號管 0pg/ml（試驗樣品空白）
吸取230ul的標(biāo)準(zhǔn)品于1號管混勻，然后從1號管吸取230ul加入2號管，依次連續(xù)稀釋，標(biāo)準(zhǔn)品范圍為500~7.81ng/ml
內(nèi)部實驗步驟（4℃下孵育過夜）
高靈敏度所必須的操作步驟
1） 標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備：吸取2.0ml的去離子水至標(biāo)準(zhǔn)品瓶內(nèi)，充分混勻，得到500pg/ml的人G-CSF標(biāo)準(zhǔn)品
2） 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：準(zhǔn)備9個試管用于標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋，每管加入230ul的EIA緩沖液
每管的濃度如下
1號管 250 pg/ml
2號管 125pg/ml
3號管 62.5pg/ml
4號管 31.25pg/ml
5號管 15.63pg/ml
6號管 7.81pg/ml
7號管 3.91pg/ml
8號管 1.95pg/ml
8號管 0pg/ml（試驗樣品空白）
吸取230ul的標(biāo)準(zhǔn)品于1號管混勻，然后從1號管吸取230ul加入2號管，依次連續(xù)稀釋，標(biāo)準(zhǔn)品范圍為250~1.95pg/ml,9號管為試驗樣品空白
5. 樣品稀釋：樣品用EIA緩沖液稀釋。如果樣品濃度事先沒有建立，我們建議，先用幾個不同稀釋比例的樣品進行檢測，來確定樣品*稀釋比例
實驗步驟
使用前，所有樣品應(yīng)平衡至室溫，大約30min，然后充分混勻，確保試劑質(zhì)量無變化，標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品檢測同時進行
如圖：
1. Reagent Blank孔內(nèi)加入100ul的EIA緩沖液
2. 將試驗樣品空白對照，樣品和稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品加100ul至相應(yīng)的孔內(nèi)；（內(nèi)部操作程序一樣）
3. 蓋板，37℃下孵育1小時（4℃下孵育過夜）
4. 洗板，重復(fù)7次以上，吸水紙上拍干；洗板機則洗板4次
5. 每孔加入100ul的標(biāo)記抗體液，除Reagent Blank孔外
6. 蓋板，37℃下孵育30min
7. 洗板9次，同步驟四
8. 吸取試驗所需的TMB底物液于一次性試管內(nèi)，每孔加入100ul的TMB底物液。剩余的TMB底物液不能再放回至原裝瓶內(nèi)，避免污染
9. 黑暗處，室溫下孵育30min，溶液變藍
10. 每孔加入100ul的終止液，溶液變藍
11. 擦去微孔板底部的污點或水滴，終止液加入后30min內(nèi)，在酶標(biāo)儀450nm處讀數(shù)
特別注意
1. 試驗樣品采集后應(yīng)立即檢測，凍存的樣品避免反復(fù)凍融，檢測前應(yīng)先將其*溶解混勻
2. 試驗樣品用EIA緩沖液稀釋
3. 試驗樣品和標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)做雙份檢測
4. 試驗樣品應(yīng)在中性PH范圍，有機溶劑的污染可能會影響檢測
5. 只能用試劑盒提供的洗滌液洗板，否則會導(dǎo)致試驗失敗
6. 吸水紙上拍干微孔板，不能擦拭
7. TMB底物液應(yīng)貯存于黑暗處，因其對光敏感，且避免接觸金屬
8. 加入終止液后30min內(nèi)必須酶標(biāo)儀讀數(shù)
結(jié)果計算
繪制曲線前，所有的數(shù)據(jù)都應(yīng)減去試驗樣品空白值，包括標(biāo)準(zhǔn)品和未知的樣品。以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值和濃度在對數(shù)-對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可直接讀取未知樣品的濃度
附：采用全自動酶標(biāo)儀檢測，只需檢測前設(shè)置好酶標(biāo)儀的相關(guān)參數(shù)，如坐標(biāo)參數(shù)（線性，半對數(shù)）和計算方式參數(shù)（三次回歸、四參數(shù)或雙對數(shù)曲線方程），即可直接得到結(jié)果
附錄一：
本譯文僅供參考，詳情請以原文為準(zhǔn)。
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