孕酮ELISA 試劑盒
（德國(guó)DRG：EIA-1561）
1、前言
孕酮是一種類固醇激素，含21個(gè)碳原子，在C-3上連有酮基，在C-4與在C-5之間為雙鍵連接。該類固醇激素是一種女性性激素，與雌激素共同在月經(jīng)周期中調(diào)節(jié)附屬的器官，它對(duì)于胚細(xì)胞著床前的子宮內(nèi)膜增生狀態(tài)和維持孕期是特別重要的。在非孕期婦女懷孕的胎盤成為主要來(lái)源。極少數(shù)來(lái)源于兩性的腎上腺皮質(zhì)。孕酮在循環(huán)血中主要與皮質(zhì)類固醇結(jié)合蛋白（CBG），性激素結(jié)合蛋白（SHBG）和白蛋白結(jié)合，僅有循環(huán)總濃度的2-10%是游離激素。根據(jù)月經(jīng)循環(huán)周期血孕酮濃度范圍很寬，在卵泡期可以低于1ng/ml（3.2nmol/L），在黃體期達(dá)到10-20ng/ml（32-64nmol/L）。在排卵后4-7天達(dá)到zui高水平保持4-6天，在月經(jīng)開(kāi)始前24小時(shí)降至排卵前的水平，因?yàn)樵型纳吆徒档团c卵巢卵泡和黃體的活動(dòng)相對(duì)應(yīng)，因此血漿孕酮的測(cè)定在臨床上常用來(lái)證明排卵和非孕婦女的黃體功能正常。假如排卵沒(méi)有發(fā)生，黃體則沒(méi)有生成進(jìn)而孕酮升高的循環(huán)也不能見(jiàn)到，異常的孕酮分泌與經(jīng)前期緊張子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)和黃體不全有關(guān)。孕酮濃度不僅個(gè)體之間有差異，而且同一個(gè)人每天甚至每個(gè)小時(shí)都會(huì)不同，一般的在婦科內(nèi)分泌紊亂或異常妊娠為了恰當(dāng)?shù)慕忉尣∫蜻B續(xù)測(cè)定比單個(gè)測(cè)定更有意義。在孕期孕酮更多的由胎盤產(chǎn)生，血漿水平在這個(gè)時(shí)期穩(wěn)定在200ng/ml的水平。
2、實(shí)驗(yàn)原理
DRG公司的孕酮酶免試劑盒是一種基于競(jìng)爭(zhēng)法原理的固相酶免吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）。反應(yīng)板上的微檢測(cè)孔包被有能結(jié)合孕酮分子上*抗原位點(diǎn)的單克隆抗體。一份含有內(nèi)源性孕酮的病人樣本與辣根過(guò)氧酶標(biāo)記的孕酮競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合包被板上的抗體。溫育之后，未結(jié)合的酶聯(lián)物用洗滌液洗去。過(guò)氧酶與包被抗體的結(jié)合量與樣品中孕酮的濃度成反比。加入底物液后，所顯示的顏色強(qiáng)度與病人樣品中孕酮的濃度成反比。
3、試劑盒成分
1） 預(yù)包被反應(yīng)板 ，12條X8孔，96孔，微孔中包被了單克隆的抗孕酮抗體。
2） 標(biāo)準(zhǔn)品系列，7支，1ml，濃度：0；0.3；1.25；2.5；5；15；40ng/ml，轉(zhuǎn)換系數(shù)：1ng/ml=3.18nmol/ml，內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑，
3） 酶聯(lián)結(jié)物 ，1支，25ml，辣根過(guò)氧酶標(biāo)記的孕酮，內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑。
4） 底物液，1支，25ml，TMB
5） 終止液，1支，14ml，內(nèi)含0.5M的H2SO4
6） 濃縮洗滌液（40X），1支，30ml.
注：用于樣品稀釋的零標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)視需要而定。
4、實(shí)驗(yàn)需要器材（但試劑盒不提供）
1） 酶標(biāo)儀（450±10nm）。
2） 移液器
3） 吸水紙
4） 蒸餾水
5、試劑貯存:
未開(kāi)啟的試劑在2—8℃下貯存時(shí)，其活性在有效期內(nèi)穩(wěn)定，不要使用過(guò)期試劑。所有開(kāi)封了的試劑都必須儲(chǔ)存于2-8℃的環(huán)境下，微孔反應(yīng)板也必須貯存于2—8℃的環(huán)境下。一旦包裝袋被打開(kāi)，必須將它小心地嚴(yán)封起來(lái)。
6、試劑準(zhǔn)備
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將所有的試劑和所需數(shù)目的板條都平衡至室溫。
洗滌液：在30ml的濃縮洗滌液中加入1170ml去離子水進(jìn)行稀釋，稀釋好的洗滌液室溫下可穩(wěn)定存放2周。
7、樣本采集和準(zhǔn)備
此實(shí)驗(yàn)中要使用到血清或血漿（EDTA-，肝素血漿），不要使用溶血、黃疸血或脂血樣品。請(qǐng)注意：含疊氮鈉的樣品不能用于此實(shí)驗(yàn)中。
7.1樣品的采集
血清：靜脈穿刺采集全血，待其凝血，在室溫下用離心機(jī)分離血清。未*凝血前請(qǐng)勿離心，接受了抗凝劑治療的病人樣品可能需要更長(zhǎng)的凝血時(shí)間。
血漿：將全血收集到含抗凝劑的離心試管中，采集后立即離心。
7.2樣品的儲(chǔ)存
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，應(yīng)當(dāng)將樣品用蓋子蓋好，2-8℃環(huán)境下可穩(wěn)定存放24個(gè)小時(shí)。如果實(shí)驗(yàn)前想要將樣品存放更長(zhǎng)的時(shí)間，則應(yīng)將樣品凍存于-20℃的環(huán)境下。解凍的樣品在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)反復(fù)倒置幾次。
7.3樣品的稀釋
在實(shí)驗(yàn)時(shí)，如果血清樣品中睪酮的濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品中睪酮的濃度，則應(yīng)將此樣品用零標(biāo)準(zhǔn)品稀釋10或100倍，并按實(shí)驗(yàn)步驟重新檢測(cè)。在計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)當(dāng)將此稀釋因子考慮進(jìn)去。
例如：
a） 按1：10的比例稀釋：10μl的血清+90μl零標(biāo)準(zhǔn)品（充分混合）
b） 按1：100的比例稀釋：10μl已稀釋好的a）+90μl零標(biāo)準(zhǔn)品（充分混合）
8、實(shí)驗(yàn)步驟：
1） 將所需數(shù)量的板條固定到板架上。
2） 將標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和已稀釋好的樣品分別用新的取樣吸頭取25μL加入到相應(yīng)的微孔中。
3） 室溫溫育5分鐘。
4） 在每一微孔中加入200μL酶聯(lián)物。
5） 充分混勻10秒，在這個(gè)步驟*混勻很重要。
6） 室溫孵育60分種。
7） 快速棄去孔內(nèi)反應(yīng)物，每孔用400μL蒸餾水洗板3次，在吸水紙上拍干。注意：洗板步驟是否正確操作會(huì)明顯影響實(shí)驗(yàn)的靈敏度和度。
8） 在每一微孔中加入200μl底物液。
9） 室溫孵育15分種。
10） 加100μl終止液到每個(gè)檢測(cè)孔中終止酶反應(yīng)。
11） 加終止液后10分鐘之內(nèi)，用酶標(biāo)儀在450±10nm處測(cè)定OD 值。
9、結(jié)果計(jì)算
1） 計(jì)算每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和病人樣本的平均吸光度值。
2） 用吸光度值作為縱坐標(biāo)（y），濃度值作為橫坐標(biāo)（x），以每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值對(duì)其相應(yīng)的濃度值進(jìn)行標(biāo)繪，作一標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3） 用每一樣品的平均吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定其相應(yīng)的濃度。
4） 自動(dòng)計(jì)算方法：在IFU上，它用四參數(shù)曲線已自動(dòng)計(jì)算出結(jié)果。其它的歸納方法可能會(huì)得出稍微不同的結(jié)果。
5） 樣品的濃度可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取。樣品中孕酮濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品的必須用進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋。在計(jì)算樣品濃度時(shí)就應(yīng)當(dāng)把此稀釋因子考慮進(jìn)去。
10、參考值
我們強(qiáng)烈建議各個(gè)實(shí)驗(yàn)市都建立自己的正常值和異常值。在一明顯正常人群的研究中，我們使用DRG公司的孕酮ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)得到如下結(jié)果：
正常女性：
卵泡期 0.2 - 1.4ng/ml
黃體期 4 – 25ng/ml
絕經(jīng)期 0.1 – 1ng/ml
正常男性： 0.1 – 1ng/ml
本譯文僅供參考，詳情請(qǐng)以原文為準(zhǔn)。
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