雌二醇 （E2） ELISA試劑盒（德國DRG：EIA2693）
1、前言說明
E2是一種含一個酚A環(huán)的18C類固醇激素。此類固醇激素的分子量為272.4，它是人體中zui有效的雌激素，主要由女性卵巢的格拉芬卵泡和胎盤產(chǎn)生，少量由腎上腺和男性睪丸產(chǎn)生。E2（雌二醇）被分泌到血液中，在血液中有98%的雌二醇會結(jié)合到性激素結(jié)合蛋白上，有的還會結(jié)合到其它血清蛋白上（如血清白蛋白），只有很少一部分以游離形式存在。雌激素的活性會受到雌二醇受體符合物的影響，此符合物可在靶位并在核酸水平上引發(fā)相應(yīng)的反應(yīng)。這些靶位包括：卵泡、子宮、乳房、陰道、尿道、下丘腦、垂體和敏感稍低的肝臟與皮膚。在月經(jīng)周期正常的未懷孕女性體內(nèi)，雌二醇的分泌遵循著一種循環(huán)模式，在排卵前有兩個明顯的高峰期。高濃度的雌二醇可在垂體水平發(fā)揮正反饋作用，它會影響垂體促性腺激素的分泌,如卵泡刺激素和黃體生成素，前者是卵泡成熟所必要的，后者是排卵形成所必要的。排卵后，雌二醇水平迅速下降直到黃體細(xì)胞被激活，結(jié)果雌二醇水平出現(xiàn)第二次高峰，并在黃體階段達(dá)到一平衡述評。在懷孕期間，母體血清雌二醇的水平會極度的增加，并且會超過排卵前的峰值，而且在整個孕期維持在高水平上。血清雌二醇的檢測是評價各種月經(jīng)功能障礙的一個有效指標(biāo)，例如女性早熟和晚熟，原發(fā)性、續(xù)發(fā)性閉經(jīng)和絕經(jīng)癥。據(jù)報道，女性化綜合征、男子女性型乳房和睪丸癌患者的血清雌二醇水平會升高。在不孕患者體內(nèi)，血清雌二醇的檢測有利于監(jiān)測藥物治療（如克羅米酚檸檬酸鹽、促黃體生成素釋放激素或外源性促性腺激素）后排卵的感應(yīng)情況。在因為體外受精而引起的卵巢過度刺激綜合征患者中，每天監(jiān)測血清雌二醇濃度以便為hCG的管理和卵母細(xì)胞的采集提供*時間。
2、檢測原理:
DRG公司的雌二醇酶免試劑盒是一種基于競爭法原理的固相酶免吸附實驗（ELISA）。反應(yīng)板上的微檢測孔包被有能結(jié)合雌二醇分子上*抗原位點的單克隆抗體。一份含有內(nèi)源性雌二醇的病人樣本與辣根過氧酶標(biāo)記的雌二醇競爭性的結(jié)合包被板上的抗體。溫育之后，未結(jié)合的酶聯(lián)物用洗滌液洗去。過氧酶與包被抗體的結(jié)合量與樣品中雌二醇的濃度成反比。加入底物液后，所顯示的顏色強度與病人樣品中雌二醇的濃度成反比。
3、試劑盒成分:
1） 包被板，12×8（可拆），96孔，微孔中包被了抗雌二醇的兔單克隆抗體。
2） 標(biāo)準(zhǔn)品：7支1.0ml/支。分別含量為：0；25；100；250；500；1000；2000pg/ml。 （1pg/ml=3.67pmol/L）
3） 酶聯(lián)結(jié)物：1支，25 ml，內(nèi)含辣根過氧化物酶標(biāo)記的雌二醇。
4） 底物液：1支，內(nèi)含，14ml ，內(nèi)含TMB
5） 終止液：1支，0.5M的 H2SO4，14ml，避免接觸終止液，以免造成刺激皮膚和著燒皮膚。
6） 洗滌液（40×），1支，30ml
注：用于樣品稀釋的零標(biāo)準(zhǔn)品視需要而定。
4、實驗需要器材（但試劑盒不提供）
1） 酶標(biāo)儀（450±10nm）。
2） 微量移液器和吸嘴 25μl、100μl、200μl。
3） 坐標(biāo)紙。
4） 去離子水。
5、試劑貯存:
未開啟的試劑在2—8℃下貯存時，其活性在有效期內(nèi)穩(wěn)定，不要使用過期試劑。所有開封了的試劑都必須儲存于2-8℃的環(huán)境下，微孔反應(yīng)板也必須貯存于2—8℃的環(huán)境下。一旦包裝袋被打開，必須將它小心地嚴(yán)封起來。
6、試劑準(zhǔn)備
實驗開始前，將所有的試劑和所需數(shù)目的板條都平衡至室溫。
洗滌液：在30ml的濃縮洗滌液中加入1170ml去離子水進(jìn)行稀釋，稀釋好的洗滌液室溫下可穩(wěn)定存放2周。
7、樣本采集和準(zhǔn)備
7.1樣品的采集
血清：靜脈穿刺采集全血，待其凝血，室溫下離心獲取血清。
血漿：將全血收集到含抗凝劑的離心試管中，采集后立即離心。
7.2樣品的儲存
實驗開始前，應(yīng)當(dāng)將樣品用蓋子蓋好，2-8℃環(huán)境下可穩(wěn)定存放5天。如果實驗前想要將樣品存放更長的時間，則應(yīng)將樣品凍存于-20℃的環(huán)境下。解凍的樣品在實驗前應(yīng)反復(fù)倒置幾次。
7.3樣品的稀釋
在實驗時，如果血清樣品中睪酮的濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品中睪酮的濃度，則應(yīng)將此樣品用零標(biāo)準(zhǔn)品稀釋10或100倍，并按實驗步驟重新檢測。在計算濃度時應(yīng)當(dāng)將此稀釋因子考慮進(jìn)去。
例如：
a） 按1：10的比例稀釋：10μl的血清+90μl零標(biāo)準(zhǔn)品（充分混合）
b） 按1：100的比例稀釋：10μl已稀釋好的a）+90μl零標(biāo)準(zhǔn)品（充分混合）
8、實驗步驟:
所有的標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和質(zhì)控品都做雙份檢測以保證所有的檢測條件都相同。
1） 將所需數(shù)量的板條固定到板架上。
2） 將標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和已稀釋好的樣品分別用新的取樣吸頭取25μL加入到相應(yīng)的微孔中。
3） 在每一微孔中加入200μL酶聯(lián)物。
4） 充分混勻10秒，在這個步驟*混勻很重要。
5） 室溫孵育120分種。
6） 快速棄去孔內(nèi)反應(yīng)物，每孔用400μL洗滌液洗板3次，在吸水紙上拍干。注意：洗板步驟是否正確操作會明顯影響實驗的靈敏度和度。
7） 在每一微孔中加入100μl底物液。
8） 室溫孵育15分種。
9） 加50μl終止液到每個檢測孔中終止酶反應(yīng)。
10） 加終止液后10分鐘之內(nèi)，用酶標(biāo)儀在450±10nm處測定OD 值。
9、結(jié)果計算:
1） 計算每個標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和病人樣本的平均吸光度值。
2） 用吸光度值作為縱坐標(biāo)（y），濃度值作為橫坐標(biāo)（x），以每個標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值對其相應(yīng)的濃度值進(jìn)行標(biāo)繪，作一標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3） 用每一樣品的平均吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定其相應(yīng)的濃度。
4） 自動計算方法：在IFU上，它用四參數(shù)曲線已自動計算出結(jié)果。其它的歸納方法可能會得出稍微不同的結(jié)果。
5） 樣品的濃度可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取。樣品中HPL濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品的必須用進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋。在計算樣品濃度時就應(yīng)當(dāng)把此稀釋因子考慮進(jìn)去。
10、參考值
我們強烈建議各個實驗市都建立自己的正常值和異常值。在一明顯正常人群的研究中，我們使用DRG公司的雌二醇ELISA試劑盒進(jìn)行檢測得到如下結(jié)果：
| 人群 | 5-95% |
| 男性 | 10-36pg/ml |
| 女性 絕經(jīng)期前 絕經(jīng)期后 | 13-191pg/ml 11-65pg/ml |
本譯文僅供參考，詳情請以原文為準(zhǔn)。
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